Met de komst van de Reformatie ziet de Illustre Lieve Vrouwe Broederschap zich genoodzaakt tot ingrijpende hervorming. Het gezelschap wordt in deze periode geconfronteerd met het inboeten aan betekenis van de Mariadevotie en een drastische terugloop in ledenaantal. En nadat prins Frederik Hendrik ‘s-Hertogenbosch inneemt en op zijn nadrukkelijke verzoek de protestantse gouverneur met enige van zijn vrienden tot de Broederschap worden toegelaten, dienen de statuten te worden aangepast. Vanaf 1642 zal de Broederschap bestaan uit 18 katholieke en 18 protestantse broeders, aangevuld met kandidaat-broeders uit beide geloofsstromingen. De verering van de Illustre Lieve Vrouwe als kernactiviteit komt hiermee te vervallen en wordt vervangen door het bevorderen van de eenheid onder Christenen. Deze samengang tussen katholieken en protestanten maakt de Illustre Lieve Vrouwe Broederschap tot een van de oudste oecumenische gezelschappen ter wereld. De overige activiteiten die de Broederschap van oudsher uitvoert ter versterking van de onderlinge band en ter verzorging van de armen, blijven wel navolging vinden. Samen met het bevorderen van de Christeneenheid en het beheren en uitdragen van het eigen culturele erfgoed vormen zij vandaag de dag de vier pijlers waar de Illustre Lieve Vrouwe Broederschap haar beleid op formuleert.